近期，非洲豬瘟I型毒株被報道，豬場對于該類毒株的演變和毒力不太了解，因此查閱相關文獻后，對該類毒株做了一個較為詳細的分析，其中不少豬場關心對該類毒株的鑒別診斷，在文章中介紹了幾種方案，第一種是直接測序分型（文章中有引物序列），第二種是通過對MGF和eGFP基因組合的鑒定，對毒株的分型進行推論，下面為詳細內容。

一、中國境內非洲豬瘟I型毒株的報道

1.1哈獸研對基因I型毒株的報道

中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家非洲豬瘟專業實驗室首次報道，基因I型非洲豬瘟病毒已入侵我國田間豬群，并可引起慢性感染發病。相關研究論文“Genotype I African swine fever viruses emerged in domestic pigs in China and caused chronic infection”于2021年10月28日在線發表在《新發微生物與感染(Emerging Microbes & Infections)》雜志上。

國家非洲豬瘟專業實驗室科研人員在流行病學監測及病原學研究過程中，從山東和河南兩地豬場臨床發病豬樣品分離出兩株基因 I 型非洲豬瘟病毒SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21，兩株病毒均無血吸附活性。全基因組進化分析表明，這兩株病毒與上世紀葡萄牙分離的基因I型低致死毒株NH/P68和OURT88/3高度相似，與歐洲及非洲早期分離的基因I型強毒株L60和Benin 97存在較大差異(圖1)。SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21盡管全基因組序列高度相似，但部分基因存在明顯突變差異，提示二者有可能屬于不同的入侵來源(圖1)。NH/P68于1968年從葡萄牙的一頭具有慢性癥狀的家豬中分離， OURT88/3于1988年從葡萄牙豬場的軟蜱中分離[1]。

基因I型ASFV主要分為強毒力毒株（例如，L60和Benin97）和弱毒力毒株（例如，NH/P68和OURT88/3）；我國的SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21的基因串行分別與NH/P68和OURT88/3高度相似。

圖1：根據SD/DYI/21、HeN/ZZ-P1/21和GenBank數據庫中70株參考菌株的全基因組序列構建的系統發育樹(括號內為登錄號)。Gi，所有菌株均為I型ASFVs。Gii，所有菌株都是II型ASFVs。紅色黑體表示本研究中的分離株

1.2非洲豬瘟病毒的分型

由于ASFV沒有明確的血清分型，在進行流行病學調查時多依賴與分離毒株的遺傳進化分析，以實現基因分型和研究?，F在常用有病毒遺傳進化分析的基因包括p72、pB602L和p54基因。

ASFV p72基因3’末端的478b核苷酸序列在不同毒株之間有明顯的差異，常被用于遺傳進化分析，據此可將ASFV分離株分為22個基因型。如下圖2，是運用neighbor-joining進化樹算法對1973-1999年非洲分離的42豬ASFV用P72基因進行遺傳進化分析[2]。

圖2：運用neighbor-joining進化樹算法對1973-1999年非洲分離的42豬ASFV用P72基因進行遺傳進化分析

1.3 非洲豬瘟毒株的分型引物

非洲豬瘟病毒擴增p72基因分型的通用型引物P72-U (5’-GGCACAAGTTCGGACATGT-3’) and P72-D (5’-GTACTGTAACGCAGCACAG-3’），我國首例非洲豬瘟病毒確診時進行分型，使用該對引物[3]。

圖3：我國首例非洲豬瘟毒株的P72基因遺傳進化分析

二、SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21毒株的毒力

為了確定所分離到的基因I型毒株的致病性，研究者把山東株在活豬上進行了測試。每組6頭SPF豬分別肌注10^3 TCID50 和10^6 TCID50劑量的病毒。在接種后的第3-18天，所有被攻毒的豬都不同程度表現出間歇性發熱。在10^6劑量的攻毒組中，三頭豬在第11天開始在頸部、耳后、腹部甚至全身的皮膚上出現丘疹。從第 13 天和第 17 天開始，所有六頭豬都開始出現關節??；兩只豬分別在接種后第 14 天和第 25 天開始跛行。兩只豬分別在注射后第 17 天和第 20 天出現多發局灶性皮膚壞死。在 28 天的觀察期內，所有的豬都存活了下來。

圖4：基因I型分離株SD/DY-I/21引起慢性感染發病

為了評估病毒脫落和病毒血癥的情況，對實驗豬進行了口腔拭子、直腸拭子和血液樣本的采集，每隔一天使用 qPCR 檢測ASFV基因組DNA。對于接種了 10^6 TCID50 山東株的豬，在第5天的口腔拭子、第7天的直腸拭子和第7天的血液中可檢測到病毒 DNA。對于接種了 10^3 TCID50 病毒的豬，在接種后第 9 天的口腔拭子、接種后第 11 天的直腸拭子和接種后第 7 天的血液中可檢測到病毒 DNA。在所有接種豬感染后超過 28 天，在口腔和直腸拭子中檢測到病毒 DNA。一般來說，與直腸拭子相比，口腔拭子中的病毒脫落更早且水平更高。

三、臨床毒株分型方案

3.1使分型引物對P72基因擴增后分析。

p72基因分型的通用型引物P72-U (5’-GGCACAAGTTCGGACATGT-3’) and P72-D (5’-GTACTGTAACGCAGCACAG-3’）。

3.2 MGF天然缺失可作為檢測依據。

NH/P68于1968年從葡萄牙的一頭具有慢性癥狀的家豬中分離， OURT88/3于1988年從葡萄牙豬場的軟蜱中分離，NH/P68與OURT88/3自然缺失了大量基因，其中哈獸研雙缺失疫苗中缺失的一個基因MGF360-505R在NH/P68與OURT88/3毒株中也是缺失的，因此豬場可對檢測出的陽性樣本，進行MGF360-505R檢測，如存在MGF360-505R可判定為II型，如缺失了MGF360-505R則可能為II型假疫苗或I型毒株。

圖5：SD/DY-I/21和HeN/ZZ-P1/21全基因組與歐洲及非洲早期基因I型分離株的比較分析

3.3對熒光基因進行鑒別

哈獸研與軍事獸醫研究所所披露的非瘟疫苗中均使用了熒光基因，哈獸研使用熒光基因為mCherry和eGFP，軍事獸醫研究所使用的熒光基因為RFP和eGFP，因此豬場可對檢測出來的陽性樣本，再次測試eGFP基因，當為陽性時，可以判斷為II疫苗毒株。

圖6：哈獸研雙缺失疫苗

圖7：ASFV基因缺失病毒構建策略圖

表1：不同非洲豬瘟毒株中p72、MGF、eGFP基因

注：√為含有，×為不含有。

四、對臨床的影響 

4.1 非瘟I型毒株與上半年發現的II型變異毒株，在臨床上較為類似，且該毒株流行已久，豬場不必過于驚慌。

4.2毒株重組。

今后可能會出現不同基因型毒株的重組，防控難度可能會增加。

4.3對疫苗研發的影響。

相關機構研發非洲豬瘟疫苗時，需要考慮對I型毒株的保護力了，疫苗研發難度增加。

參考文獻：

[1]Sun Encheng,Huang Lianyu,Zhang Xianfeng,Zhang Jiwen,Shen Dongdong,Zhang Zhenjiang,Wang Zilong,Huo Hong,Wang Wenqing,Huangfu Haoyue,Wang Wan,Li Fang,Liu Renqiang,Sun Jianhong,Tian Zhijun,Xia Wei,Guan Yuntao,He Xijun,Zhu Yuanmao,Zhao Dongming,Bu Zhigao. Genotype I African swine fever viruses emerged in domestic pigs in China and caused chronic infection.[J]. Emerging microbes & infections,2021:

[2] Boshoff C I ,  Bastos A ,  Gerber L J , et al. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999).[J]. Veterinary Microbiology, 2007, 121(1-2):45-55.

[3]王清華, 任煒杰, 包靜月,等. 我國首例非洲豬瘟的確診[J]. 中國動物檢疫, 2018, 35(9):4.