分享過聽課筆記，但很少與各位一起分享探討過實驗筆記，為什么同樣的實驗在不同的人手里，實驗結果可能存在些微差異，主要就在于操作細節，近期計劃分享ta們（豐富經驗）的實驗筆記，今天是RNA提取的實驗筆記，講述RNA提取細則，以期為一線實驗員提供借鑒參考，也歡迎廣大實驗員共同探討與分享。

RNA不太穩定的原因

● 內因：核糖2-羥基可在堿性條件下形成烷氧負離子，并可向3-位磷酸二酯鍵進行分子內的親核進攻(向磷-氧雙鍵)，形成五元環的環狀磷酸二酯，同時離去部分RNA 片段，造成RNA降解；

● 外因：生物體內部和外部環境中存在大量的RNase,并且RNase不易失活，高溫下仍能正確的折疊恢復活性。

如何盡量避免RNase的影響？

● 取樣端：

取樣過程要取樣過程要迅速，所取組織樣本離體后，經迅速清洗等處理后，最好立即置于液氮中速凍至少1h以上，之后再轉移至-80℃進行保存。液氮速凍能有效抑制樣本中內源性Rnase的釋放。

● 運輸端：

保證運輸的低溫性，最好加干冰。

● 耗材端：

（1）使用無菌無核酸酶低吸附的槍頭、收集管等耗材；

（2）所有使用的剪刀，鑷子等需經滅菌消毒后使用，且不能交叉使用。

（3）實驗臺面需每天使用快速清除Rnase的試劑進行擦拭清潔。

● 實驗端：

（1）實驗中必須戴口罩，以及勤換手套，長發盤起或綁起，在冰上操作時動作要迅速；

（2）嚴格執行實驗標準操作，試劑使用前進行檢查，減少實驗中出現的失誤；

（3）實驗環境污染，人體自然脫落的皮屑或是皮膚攜帶的細菌霉菌等微生物都可能成為RNA酶的來源從而影響RNA的提取。因此，在實驗過程中要養成嚴謹的無菌操作習慣，防止微生物污染。

▲ 戴手套，無菌操作

如何提高核酸得率？

● 不同樣品其RNA含量往往差別很大：高豐度（2~4 μg/mg）的如：肝臟、胰腺、心臟，中豐度（0.05~2 μg/mg）的如：腦、胚胎、腎臟、肺、胸腺、卵巢，低豐度（<0.05 μg/mg）的如：膀胱、骨、脂肪。

● 選擇合適的RNA抽提方法：根據樣本的組織類型選用合適的抽提方法，當樣本比較珍貴時，可以先取少量樣本進行提取方法的摸索，確定方法后再進行后續提取。

● 裂解細胞使RNA盡可能完全被釋放出來——電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也需根據具體情況結合其它方法，如液氮搗碎，酶消化等。

● 優化抽提方法：苯酚法的最大問題是分層不徹底導致部分RNA的丟失（不能全部將上清液取出），其原因是核酸和蛋白質含量高，可通過增加裂解液用量或者降低樣品量來改善。若樣品是脂肪組織，則需增加一步氯仿抽提。如果RNA丟失，可用反抽法或者去除有機層后再離心的方法解決。柱離心法的最大問題是樣品過量。

RNA抽提9大細節

1. 盡量避免RNase的影響，快速阻止RNase活性，樣品經前處理后快速冷凍裂解時，要快速操作滅活RNase；

2. 選擇合適的抽提方法。核酶含量高的組織及脂肪組織最好用苯酚法處理。

3. 預判質量要求。RT-PCR對完整性要求不是很高，但RT-PCR對純度（酶抑制物殘留）要求很高。

4. 徹底勻漿是提高得率和降低降解的關鍵。

5. 去除DNA。用于RT-PCR時，最好用DNase I去除DNA。

6. 降低外源酶的污染。

7. 低濃度核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑，但要防止助沉淀劑含酶及DNA。

8. 徹底溶解RNA，必要時可以65℃加熱5分鐘。

9. 根據需求選擇合適的保存方法。短時間可-20℃保存，長期請存于-80℃，避免反復凍融。